Differences in the replicative capacities of clinical isolates of dengue virus in C6/36 cells and in urban populations of Aedes aegypti from Colombia, South America

ABSTRACT Dengue, the most prevalent arboviral disease worldwide, is caused by any of the four dengue virus (DENV) serotypes that co-circulate constantly in hyperendemic areas such as Medellin (Colombia), and these serotypes are transmitted by mosquitoes of the genus Aedes. In this study, we evaluated the replicative capacity of strains isolated in Medellin between 2003 and 2007 in C6/36 cells and in colonies of Aedes aegypti collected during 2010-2011 from high or low-incidence areas within the same city. The phylogenetic analysis grouped isolates according to the predominant genotypes found in the Americas, and the in vitro characterization showed differences in the morphological changes induced by the isolates of each of the isolated serotypes compared to the reference serotypes. In vitro replicative capacity studies demonstrated that genomic copy number increased at four days post-infection and that cell viability decreased significantly compared to the control for all serotypes. The largest number of genomic copies in C6/36 was produced by DENV-2, followed by DENV-1 and DENV-4; DENV-3 produced the smallest number of genomic copies and had the smallest negative effect on cell viability. Finally, differences in the in vivo replication of intercolonial serotypes between the Rockefeller colony and the field colonies and among the intracolonial serotypes were found. The replication of DENV-2 at 7 and 14 days in both high- and low-incidence colonies was higher than that of the other serotypes, and replication of DENV-3 in the mosquito colonies was the most stable on the days evaluated. Our results support the notion that replication and, possibly, DENV transmission and severity depend on many factors, including serotype and vector characteristics.

Analysis of hepatitis B virus genotypes by restriction fragment length polymorphism / Análisis de genotipos del virus de la hepatitis B mediante el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción

Introduction: Ten viral genotypes (A-J) distributed in all continents have been described for hepatitis B virus (HBV). One of the methodologies for determining the viral genotype is the restriction fragment length polymorphism (RFLP) technique, a simple and relatively inexpensive method, albeit with some limitations. Objective: The initial objective of the project was to identify the HBV genotypes by RFLP in serum samples obtained from patients and blood donors. However, due to the discrepancies of RFLP patterns it was also necessary to perform phylogenetic genotyping and in silico analysis of HBV sequences. Materials and methods: We obtained 56 serum samples. DNA extraction was followed by PCR amplification of a fragment of HBV ORF S. We analyzed PCR products by RFLP with Alw I, Bsr I, Cfr I, Hpa II and Sty I, and we sequenced some. We compared the patterns obtained with those in previous reports. We also performed RFLP analysis in silico since we found differences between the patterns expected and those obtained. Results: We identified genotypes A and F, subgenotype F3, in the samples. This result is in agreement with those of previous studies carried out in Colombia; indeed, subgenotype F3 is the most frequent in the Andean region of the country, while genotype A is the most frequent HBV genotype in the western region (department of Chocó). Based on the in silico analysis of 229 HBV sequences from GenBank and 11 sequences of this study, we identified the RLFP pattern for genotype F, subgenotype F3, and we described some modifications of genotype A RFLP patterns. Conclusions: We identified the single nucleotide polymorphism pattern for genotype F, subgenotype F3, by in silico analysis and sequencing. Further robust in silico analyses are necessary to validate the RFLP patterns of HBV genotype and subgenotypes.

Introducción. Se han descrito diez genotipos (A-J) del virus de la hepatitis B (HBV) que están distribuidos en todos los continentes. Una de las técnicas utilizadas para determinar el genotipo viral es el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción, un método simple y económico, pero con algunas limitaciones. Objetivo. El objetivo inicial del estudio fue identificar el genotipo del HBV mediante RFLP en muestras de suero obtenidas de pacientes y donantes de sangre. Sin embargo, por las discrepancias observadas en los patrones de RFLP fue necesario realizar análisis filogenéticos y un análisis in silico de secuencias del HBV. Materiales y métodos. Se obtuvieron 56 muestras de suero. Tras la extracción de ADN, se amplificó un fragmento del ORF S del HBV mediante reacción en cadena de la polimerasa, cuyos productos se analizaron por RFLP con las enzimas Alw I, Bsr I, Cfr I, Hpa II y Sty I, y algunos se secuenciaron. Los patrones obtenidos se compararon con los reportados previamente. Se efectuó un análisis in silico de RFLP en consideración de las diferencias entre los patrones esperados y los observados. Resultados. Se identificaron los genotipos A y F, subgenotipo F3, en las muestras. Este resultado coincide con lo descrito en estudios previos en los que se ha demostrado que el genotipo F, subgenotipo F3, es prevalente en la población de la región andina del país, en tanto que el genotipo A predomina en el occidente (departamento del Chocó). Con base en el análisis in silico de 229 secuencias virales obtenidas del GenBank y las 11 secuencias de este estudio, se caracterizó un nuevo patrón de RFLP específico para el genotipo F, subgenotipo F3, y se describieron algunas modificaciones en el patrón de RFLP del genotipo A, subgenotipo A1. Conclusiones. Se caracterizó el patrón de genotipificación del genotipo F, subgenotipo F3, del HBV mediante RFLP, análisis in silico y secuenciación. Se requieren nuevos análisis in silico con un número mayor de secuencias para validar los patrones de RFLP de los genotipos y subgenotipos del VHB.

Serum levels of interleukin-6, tumor necrosis factor-alpha and interferon-gama in infants with and without dengue

This study compared the serum levels of IL-6, TNF-alpha and IFN-gamma, in children under 1 year of age with and without dengue. Sera were collected from a total of 41 children living in the Department of Antioquia, Colombia (27 patients with dengue and 14 controls). The results showed higher cytokine levels in children with dengue than without dengue, with statistically significant differences for IL-6 and IFN-gamma. No statistically significant differences were found between clinical forms, although IL-6 and IFN-gamma levels were higher in dengue fever cases than in dengue hemorrhagic fever cases. On the other hand, TNF-alpha levels were higher in dengue hemorrhagic fever than in dengue fever. The levels of IL-6 and TNF-alpha were higher in secondary infection than in primary infection, although IFN-gamma levels were higher in primary infection. These results suggest that IL-6, TNF-alpha and IFN-gamma are involved in dengue infection independently of the clinical form.

Este estudo comparou os níveis séricos de IL-6, TNF-alfa e IFN-gama, em crianças menores de um ano com e sem dengue. Os soros foram coletados de um total de 41 crianças residentes no Departamento de Antioquia, Colômbia (27 pacientes com dengue e 14 controles). Os resultados mostraram níveis de citoquinas mais elevadas em crianças com dengue do que naquelas sem dengue, com diferenças estatisticamente significativas para IL-6 and IFN-gama. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre formas clínicas, embora os níveis de IL-6 e IFN-gama estivessem mais elevados nos casos de febre do dengue que nos casos de febre hemorrágica do dengue. Por outro lado, os níveis de TNF-alfa estavam mais elevados na febre hemorrágica do dengue que na febre do dengue. Os níveis de IL-6 and TNF-alfa estavam mais elevados em infecções secundárias que em infecções primarias, embora os níveis de IFN-gama estivessem mais elevados em infecções primárias. Estes resultados sugerem que IL-6, TNF-alfa e IFN-gama estejam envolvidos na infecção do dengue, independentemente da forma clínica.

Serological markers and risk factors for hepatitis B and C viruses in patients infected with human immunodeficiency virus

Both hepatitis B and hepatitis C viruses (HBV and HCV) infection are common in HIV-infected individuals as a result of shared risk factors for acquisition. A serological study for HBV and HCV was performed in 251 HIV-positive individuals from Medellín, Colombia. A qualitative RT-PCR for HCV was done in 90 patients with CD4+ T-cell count < 150 per mm³. Serological markers for HBV infection were present in 97 (38.6 percent) patients. Thirty six of them (37.1 percent) had isolated anti-HBc. A multivariate analysis indicated that the following risk factors were significantly associated with the presence of these markers: age (OR = 1.05, 95 percent CI: 1.01-1.08), pediculosis pubis (OR = 1.83, 95 percent CI: 1.01-3.33), men who have sex with men and women (OR = 3.23, 95 percent CI: 1.46-7.13) and men who have sex only with men (OR = 3.73, 95 percent CI: 1.58-8.78). The same analysis restricted to women showed syphilis as the only significant risk factor. Thus, HBV infection was considerably associated with high risk sexual behavior. HCV was present in only two (0.8 percent) of HIV patients. Both of them were positive by RT-PCR and anti-HCV. This low frequency of HIV/HCV coinfection was probably due to the uncommon intravenous drug abuse in this population. The frequent finding of isolated anti-HBc warrants molecular approaches to rule out the presence of cryptic HBV infection.

La infección por los virus de la hepatitis B y hepatitis C (VHB y VHC) es frecuente en individuos infectados por el VIH como resultado de compartir factores de riesgo para su contagio. Se realizó un estudio serológico para el VHB y VHC en 251 individuos VIH positivos de la ciudad de Medellín, Colombia. En 90 pacientes con un recuento de linfocitos T < 150 células por mm³ se hizo una PCR-RT cualitativa para el VHC. Se encontraron marcadores serológicos para la infección por el VHB en 97 (38.6 por ciento) pacientes. Treinta y seis de 97 (37.1 por ciento) tuvieron un anti-HBc aislado. El análisis multivariado indicó que los factores de riesgo significativos asociados a la presencia de estos marcadores fueron: edad (OR = 1.05, 95 por ciento IC: 1.01-1.08), pediculosis púbica (OR = 1.83, 95 por ciento IC: 1.01-3.33), hombres que tienen sexo con hombres y mujeres (OR = 3.23, 95 por ciento IC: 1.46-7.13) y hombres que tienen sexo solo con hombres (OR = 3.73, 95 por ciento IC: 1.58-8.78). El mismo análisis restringido a mujeres mostró que la sífilis fue el único factor de riesgo significativo. Por lo tanto, la infección por el VHB fue considerablemente asociada a conductas sexuales de alto riesgo. El VHC se presentó en solo 2 (0.8 por ciento) de los pacientes VIH. Ambos pacientes fueron positivos por la PCR-RT y los anti-VHC. La baja frecuencia de la coinfección VIH/VHC fue probablemente debido al bajo uso de drogas intravenosas en esta población. El hallazgo frecuente de anti-HBc como marcador aislado asegura estudios moleculares para descartar la presencia de infección críptica por el VHB.

Dengue: diagnóstico por el laboratorio / Dengue laboratory diagnosis

El diagnóstico por el laboratorio de la infección por el virus del dengue está basado en pruebas de determinación y en la detección directa del virus. El diagnóstico serológico se realiza con base en la presencia de anticuerpos IgM o aumento en el título de anticueroos totales o IgG en sueros tomados en las fases aguda y convaleciente de la enfermedad. Los métodos directos comprenden el aislamiento viral, detección del genoma o de los antígenos del virus. Entre los sistemas de aislamiento disponibles están la inoculación de mosquitos y los cultivos en células de mamíferos o de insectos. La detección del genoma por RT – PCR permiten un diagnóstico especíico de serotipo especialmente en la fase temprana de la enfermedad. Las pruebas de inmunohistoquímica poermiten detectar el antígeno viral en tejidos y en sangre. La detección del antígeno soluble en el suero parecen tener valor en la predicción del desarrollo de FHD/SCD lo cual le daría a esta prueba una gran utilidad en el pronóstico de la enfermedad

Dengue y embarazo en Antioquia, Colombia / Dengue and pregnancy in Antioquia, Colombia

Objetivo: en Antioquia, Colombia, se realizó un estudio de cohorte en 39 gestantes con dengue y 39 gestantes sin la enfermedad entre enero de 2000 y diciembre de 2002 con el fin de determinar los efectos adversos del virus del dengue durante el embarazo y en el recién nacido. Resultados: se encontró que en el grupo de embarazadas con dengue se presentaron 7 casos de hemorragia vaginal (17,9 por ciento) (P=0,005) y 2 abortos (5,1 por ciento); una paciente falleció por dengue y se desencadenó trabajo de parto simultáneamente con la infección en 20,5 por ciento de los casos. Se presentaron 8 casos de sufrimiento fetal (21,6 por ciento) (P=0,0026) y 11 recién nacidos tuvieron un índice de Apgar menor de 7 (29,7 por ciento) (P=0,0002). Conclusión: las mujeres con infección por dengue durante la gestación tienen riesgo de hemorragia vaginal y presentan con mayor frecuencia aumento de la actividad uterina; además la infección por dengue durante el embarazo puede ser un factor desencadenante de sufrimiento fetal

Dengue en el embarazo: efectos en el feto y el recién nacido / Neonatal and postnatal effects of dengue infection during pregnancy

El riesgo de infección por el virus del dengue durante el embarazo se está incrementando ante mayores y más severas epidemias, y las consecuencias sobre el feto y el recién nacido han sido poco estudiadas y, en otros casos, los resultados han sido contradictorios. Por esta razón, se realizó en Medellín un estudio de cohorte retrospectiva, cuyo objetivo fue determinar los efectos que produce el dengue durante el embarazo sobre el feto y el recién nacido. En dicho estudio se evaluaron 22 recién nacidos hijos de mujeres que presentaron dengue durante la epidemia de 1998 y se compararon con 24 recién nacidos, hijos de mujeres embarazadas sin dengue. En la cohorte con dengue se encontraron 3 niños prematuros, 3 niños con sufrimiento fetal y 4 niños con bajo peso al nacer. En la cohorte no expuesta no se encontraron niños con estos problemas. El desarrollo psicomotor fue normal en ambos grupos. De las observaciones anteriores, sólo fue estadísticamente significativa la frecuencia de niños con bajo peso al nacer (prueba exacta de Fisher, p=0,045). Estos resultados preliminares muestran que los recién nacidos de madres que sufrieron dengue durante la gestación tuvieron riesgo de bajo peso al nacer y presentaron con mayor frecuencia prematurez y sufrimiento fetal, aunque se requiere aumentar el tamaño de la muestra para confirmar estos resultados. Sin embargo, es necesario estrechar la vigilancia a las madres embarazadas con dengue dados los efectos nocivos sobre la evolución del recién nacido.

Efectos del virus del dengue durante el embarazo. Medellín, Colombia / Dengue virus effects during pregnancy, Medellín, Colombia

El riesgo de infección durante la gestación aumenta ante mayores y más severas epidemias de dengue y sus consecuencias sobre el embarazo y el feto han sido poco estudiadas o muestran resultados contradictorios. Por este motivo el presente estudio tiene como fin describir los efectos del virus del dengue en el embarazo. Se evaluaron, mediante estudio descriptivo retrospectivo, 24gestantes que presentaron dengue durante la epidemia ocurrida en Medellín en 1998 y se compararon con 24 embarazadas sin dengue. Se consideró caso de dengue toda paciente con presencia de anticuerpos IgM contra el virus del dengue o con clínica compatible y asociaciónepidemiológica. Los hallazgos presentados en la cohorte expuesta vs cohorte no expuesta fueron los siguientes: siete casos (29.2 por ciento) de amenaza de aborto Vs dos (8.3 por ciento); dos casos (8.3 por ciento) de abortoVs ninguno; seis casos (25 por ciento) de amenaza de parto prematuro Vs cuatro (16.6 por ciento); tres casos (12.5 por ciento) de parto prematuro Vs ninguno; cuatro casos (16.6 por ciento) de ruptura prematura de membranas Vs uno (4.1 por ciento), nueve casos (37.5 por ciento) de hemorragia vaginal Vs uno (4.1 por ciento) y en cuatro pacientes de la cohorte expuesta se desencadenó trabajo de parto concomitante con el dengue. De las anteriores observaciones, sólo hubo diferencia estadísticamente significativa con respecto a la presencia de hemorragia vaginal entre los grupos de estudio (Prueba de Fisher, p < 0.05). En conclusión, las mujeres que desarrollaron infección por dengue durante la gestación, tuvieron riesgo de hemorragia vaginal y presentan con mayor frecuencia actividad uterina desencadenada por la infección, acontecimientos con efectos negativos sobre el binomio madre - hijo